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工业发酵染菌的防治
第一节工业发酵染菌的害处
1、染菌的害处
1.防止染菌的手段
为预防杂菌污染，采取如下手段：
①密闭式发酵罐；
②无菌空气；
③无菌室；
④培养基和设施灭菌；
⑤无菌操作。
2.工业发酵染菌的近况
①国内抗生素发酵、青霉素发酵的染菌率为2％；
②链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率为5%；
③谷氨酸噬菌体感染率为1％～2％
3.染菌的害处
染菌后轻者影响产率和水平，重者可能致使倒罐，增加三废（废水、废气、废渣）治理的成本和困难程度。
①青霉素：产青霉素酶的杂菌；
②疫苗：全部废弃；
③柠檬酸：主要预防前期染菌；
④谷氨酸：噬菌体风险大；
⑤肌苷、肌苷酸：易染菌。
2、染杂菌类型对发酵的影响
1.青霉素发酵：污染细短产气杆菌比污染粗大杆菌风险大；
2.链霉素发酵：污染细短杆菌和假单孢杆菌和产气杆菌比污染粗大杆菌风险大；
3.四环素发酵：怕污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌；
4.柠檬酸发酵：最怕污染青霉菌；
5.肌苷、肌苷酸发酵：最怕污染芽孢杆菌；
6.谷氨酸发酵：最怕污染噬菌体；
7.高温淀粉酶发酵：最怕污染芽孢杆菌和噬菌体。
3、不同染菌时期对发酵的影响
1.种子培养期染菌：易染菌、应灭菌后除去，并对种子罐、管道进行检查和彻底灭菌。
2.发酵前期染菌：易染菌、应特别预防，可重新灭菌，补充营养，重新接种发酵。
3.发酵中期染菌：发酵中期染菌，挽救处置困难，风险性大；
①抗生素发酵：将另一罐发酵正常、单位高的发酵液的一部分输入染菌罐中，以抑制杂菌繁殖，同时采取低通风，低流加糖量等手段;
②柠檬酸发酵：
a.污染细菌：加强通风量，加速产酸，减少pH，抑制细菌成长；
b.污染酵母：加0.025-0.035g/L硫酸铜；
c.污染黄曲霉：将另一罐接近成熟醪液，减少pH值，黄曲霉自溶；
d.污染青霉：青霉能在低pH环境下成长，可考虑提前放罐。
4.发酵后期染菌：可考虑提前放罐。
4、染菌程度对发酵的影响
1.染菌程度越大，即进入发酵罐的杂菌数目越多，对发酵的害处越大；
2.染少量杂菌，有时可以容忍；
3.前期和中期染菌，应结合染菌程度综合考虑。
5、染菌对产物提取和商品水平的影响
染菌的不好的后果果：
a.影响菌体、发酵液：菌体自溶，发酵液发粘、发臭;
b.影响过滤：过滤困难,过滤时间拉长，影响设施的周转，减少过滤收率;
c.影响产物的提取（染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质，易发生乳化，使水相和有机溶剂相很难分开；杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大减少离子交换树脂的交换量）;
d.影响商品的纯度：染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质，使商品纯度减少；
e.影响商品的外观：一些染菌的发酵液经处置过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现混浊，使商品品质遭到质疑。
第二节染菌的检查与判断
1、杂菌的检查办法
1.显微镜检查；
2.平板划线检查（24h）；
3.酚红肉汤培养检查；
4.发酵过程中DO、pH、尾气CO2及细胞酶活力等异常变化
第三节染菌的防治
1、发酵染菌率和染菌缘由剖析
（一）发酵的染菌率
染菌率＝发酵染菌批数/总投料批数×100％
染菌率与发酵的菌种、培养基、商品性质、发酵周期、生产环境条件设施和管理技术水平等有关。
（二）染菌缘由剖析
1.染菌缘由剖析的目的：总结染菌的教训，防范于未然。
2.主要染菌缘由：种子带菌、无菌空气带菌、设施渗漏、灭菌不彻底及人为操作管理不当。
3.染菌的杂菌类型剖析：
①杂菌是耐热的芽孢杆菌（灭菌、死角）；
②杂菌是球菌、无芽胞杆菌等不耐热菌（种子带菌、空气带菌，设施渗漏，管理操作等）；
③染菌为菌落呈浅绿色的杂菌如铜绿假单胞杆菌（设施或冷却盘管渗漏）
④染菌为霉菌（灭菌室灭菌不严，无菌操作不当）
⑤染菌为酵母菌（糖液灭菌不彻底，或放置时间较长）
4.染菌的规模剖析
①大量量发酵罐染菌：种子、空气；
a.前期：种子带菌，灭菌问题；
b.中后期：空气带菌；
②部分发酵罐染菌：
a.染菌发生在发酵前期：种子染菌、连消系统灭菌不彻底；
b.发酵后期染菌：中间补料染菌（补料液、补料管路）。
③个别发酵罐连续染菌：设施渗漏（阀门、罐体渗漏或清洗不彻底等）。
5.染菌的时间剖析
①种子培养阶段：种子染菌，培养基或设施灭菌不严，操作不当，设施原因等；
②发酵前期：种子染菌，培养基或设施灭菌不严，操作不当，设施原因、无菌空气带菌等；
③发酵后期：空气过滤不彻底，中间补料染菌，设施渗漏，泡沫顶盖及操作问题等。
2、染菌渠道及预防
1.种子带菌的防治
①培养基及用具灭菌要彻底，应预防假压；
②菌种在转接过程中受污染：操作不当，管理不严（缓冲间）；
③菌种在培养或保存过程中受污染（试管塞，查询的时候应该注意）。
2.无菌空气带菌及其防治：更改步骤设计，介质灭菌。
3.培养基和设施灭菌不彻底致使染菌及防治
①材料性状：淀粉质材料，升温过快或混合不均匀，易结块，团块中包埋的活菌不容易杀灭；可升温前搅拌和加淀粉酶。
②实罐灭菌时未充分排除罐内空气：导致假压，升温时，应打开排气等阀门放气。
③连续灭菌时，蒸汽重压波动大，培养基未达到灭菌温度，致使灭菌不彻底。
④设施和管道存在“死角”
死角：因为操作、设施结构、安装或人为导致的屏障等缘由，引起蒸汽不可以有效到达或不可以充分到达预定应该到达的局部灭菌部位。
4、设施渗漏引起的染菌及其预防
①发酵设施、管道、阀门长期用，因为腐蚀、摩擦和振动等缘由，导致渗漏。
②微小渗漏的检查：加入碱性水，用浸湿酚酞指示剂的白布擦，有渗漏则白布显红色。
5.操作失误致使染菌及其防治
①灭菌过程中严防泡沫升顶，尽量添加消泡剂预防泡沫很多产生；
②传感器探头用化学试剂浸泡法灭菌可能致使灭菌不彻底。
6.噬菌体污染和防治
总体防治思路：
①严格活菌体排放，切断噬菌体的粮源;
②做好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌;
③严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐内;
④抑制罐内噬菌体的成长。
污染噬菌体后的处置办法
①并罐法；
②转换用菌种或用抗性菌株；
③放罐重消法；
④罐内灭噬菌体的办法；
⑤添加噬菌体抑制剂的办法
抗生素染菌实例剖析
1、现象：一级种子罐连续染菌，菌型一致，均为芽孢杆菌，接种后24小时就当班片子种发现，量相当大。5批染3－4批。罐内无搅拌，夹套降温，罐内无结垢，可以说无死角。
2、剖析：母瓶无菌斜面正常，不接种的白料无菌试验罐也染菌（种子缘由排除），消后无菌斜面正常，接种后12小时左右的斜面能镜检出杂菌（操作缘由基本排除）。罐体内只有一取样管和一空气管，较干净，蒸汽重压和仪表温度对应好，消毒工都有十几年的工作经验，操作问题不大（为了排除操作问题，我和技术员和消毒工一同消了几个罐，无菌仍不正常）。判断有罐体内可能有料垢和死角。
3、结论：
依据我在生产中碰到和解决的无菌问题来看，靠罐阀的检修不到位导致的染菌站15％左右，包含密封垫掉落、老化，阀头掉落，外漏，内漏等等，作大生产，要不有钱买好设施，要没钱需要要有好的规范和好的操作工。依据我的生产经验看，买好设施要合算的多，染一罐少则损失几百元，多则几十万。
